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制备顿尝滨狈-惭颁3脂质纳米颗粒

　　实验目的：

　　分别以顿尝滨狈-惭颁3为阳离子主要脂质，参照文献方法制备包载尘搁狈础的尝狈笔。

　　实验原理：

　　DLIN-MC3是可解离脂质，在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质，通过静电作用于带负电的mRNA结合，形成载有mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNPs)。常见的制备方法有薄膜-水化法、溶剂注入法、高压均质法和微流控法等方法，在本实验中采用微流控法，让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的混合，形成粒径均一的LNP。由于脂质溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性缓冲液中，因此需要透析去除残余的乙醇并换液至PBS。

　　实验材料：

　　顿尝滨狈-惭颁3、顿厂笔颁、顿惭骋-笔贰骋2000、冰醋酸、叁水醋酸钠

　　实验步骤：

　　1、 配置脂质乙醇溶液：

　　　　a) LNP 的成分与分子量见下表：

　　百分比来源于前期研究，并不一定与 onpattro 和 mRNA-1273 相同。

　　　　b)每种成分别配置三个浓度：8 mM（约5 mg/ml）、12 mM（约7.5 mg/ml）和16 mM（约10 mg/ml）。

　　2、 计算 mRNA 浓度：

　　　　a) 根据 N/P=6，FRR=3 计算所需 RNA 浓度。

　　　　b) RNA 的碱基的平均分子量为340，每个碱基携带1 个磷酸，因此RNA 中的含磷量为3.1 nmol/μg.

　　　　c) 计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数，因此每摩尔混合脂质中含有 0.5 摩尔 N。

　　3、 配置 mRNA-醋酸缓冲液：

　　　　称取3.2g叁水醋酸钠，8ml冰醋酸，定容于1000ml。加入相应梯度的mRNA

　　4、 微流控混合：

　　　　a. 将脂质-乙醇溶液过 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜，mRNA-柠檬酸缓冲液过 0.22 μm 亲水聚四氟乙烯膜，过膜后装入微量注射器中。

　　　　b. 以FRR=3 ，磷脂和缓冲液以0.2ml/min和0.6ml/min，通过nexstarnano1芯片，混合。

　　5、 透析与储存：

　　　　a) 制备后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入 14 ml PBS在摇床上透析，2 小时后换液，直至 18 小时后透析结束。

　　　　b) 保存于 4℃待用。

实验名称：LNP 包封率测定

　　实验目的：

　　　　对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定

　　实验原理：

　　　　Quant-iT™RiboGreen®RNA 试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂，可检测溶液中 1-200 ng 的核酸，这种核酸染料无法透过 LNP，因此只有游离的未被 LNP 包载的核酸可以被结合。Triton-100 作为一种表面活性剂常被用做破乳剂，使用 1%的 Triton-100 处理获得的 LNP-mRNA 可以使包载的核酸释放，得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量，再除以总核酸量即可得到包封率，即：

包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量

　　实验材料：

　　　　Quant-iT ™ RiboGreen ™ RNA   检 测 试 剂 盒 （ Thermo  Fisher ， R11490 ）、 Triton ™ X-100

　　　　（SIGMA-ALDRICH，T8787-100ML）、DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates  （ PerkinElmer，6055308）、 LNP-mRNA

　　实验步骤：

　　　　1. LNP 制备：

　　　　　　见 LNP 制备流程。

　　　　2. 试剂准备（详细参见说明书）：

　　　　　　将 20xTE 用 DEPC 水稀释至 1x；

　　　　　　用稀释好的 1XTE 稀释试剂盒中的标准品，稀释成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 两种终浓度；

　　　　　　用 1xTE 稀释试剂盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen，稀释成 200 倍及 2000 倍两种终浓度； 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下试剂，做复孔：

High range

Low range

1. LNP 破乳

将 Triton-100 用 1xTE 稀释到 2%，取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入 1 μl 制备好的

LNP，处理 5 分钟，加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

2. LNP 游离核酸测定

在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE，取 1μ濒 制备好的 LNP 加进去，混匀，加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

3. 读板

使用 SPARK 读取荧光强度，激发光设置为 480 nm，发射光为 520 nm

4. 数据处理

1） 标曲制备

High range	Low range

2) 样品定量

载药量=破乳后读值-破乳前读值包封率（%）=载药量/破乳后读值